Dividido em várias salas dispostas por escolas e estilos em ordem cronológica, o museu exibe obras do século XII ao século XVIII, com a melhor coleção do mundo de obras do Renascimento. Artistas como Cimabue, Caravaggio, Leonardo da Vinci, Michelangelo, Rafael, Andrea Mantegna, Ticiano, Parmigianino, Peter Paul Rubens, Rembrandt, Giovanni Battista Pittoni, Canaletto e Sandro Botticelli.
O duque Cosmo I de Médici encomendou, ao famoso arquiteto Vasari, em 1560, uma edificação para reunir, em um só local, os escritórios (uffici) dos treze principais magistrados da cidade, então espalhados por diversos locais de Florença. Nessa nova edificação, o duque poderia, então, controlar os magistrados diretamente a partir do velho e contíguo Palazzo della Signoria, sede do governo, de acordo com o status de potência que a cidade alcançou após a conquista de Siena.
Vasari, então, projetou um prédio em forma de U com: um braço longo a leste, que deveria incorporar a antiga igreja românica de "São Pedro Scheraggio"; um tramo curto assentado na margem do rio Arno; e outro braço curto a oeste, englobando a Zecca Vecchia, sede do correio por muito tempo e, após o restauro de 1988, incorporado ao museu. Os três andares da construção começam com um térreo em loggiato delimitado por pilastras com nichos (só decorados com estátuas a partir de 1842); um segundo andar com janelas; e o terceiro destinado ao uso exclusivo do príncipe. Foi construído com pedra do vale de Mensola, adotando a ordem dórica.
Algum tempo depois, Cosmo decide unir o Palazzo Vecchio ao Palazzo Pitti, nova residência da família Médici por um caminho particular e elevado, também executado por Vasari, o chamado "Corredor de Vasari", que usava a galeria, a Ponte Vecchio sobre o Arno e uma passarela coberta sobre a rua.
