Vi sono esposte opere dei maggiori artisti italiani, spagnoli e fiamminghi, fra cui Beato Angelico, Andrea Mantegna, Raffaello Sanzio, Hieronymus Bosch, Rogier van der Weyden, Bruegel il Vecchio, El Greco, Pieter Paul Rubens, Tiziano, Diego Velázquez, Francisco Goya.
L' edificio che ospita il Museo del Prado fu voluto da Carlo III di Spagna, come il Gabinete de Historia Natural, insieme ad una serie di istituzioni di carattere scientifico situate nel progetto di riurbanizzazione chiamato Salón del Prado. A tal fine, Carlo III poté fare affidamento su uno dei suoi architetti preferiti, Juan de Villanueva, autore, oltre che della sede del Museo, del vicino giardino botanico.
Il progetto architettonico della pinacoteca attuale venne approvato nel 1786 da Carlo III, rivelandosi il culmine della carriera di Villanueva ed uno dei vertici del neoclassicismo spagnolo, benché, data la lunga durata delle opere e delle successive modifiche, il risultato definitivo si allontanerebbe abbastanza dal disegno iniziale.
Sebbene la costruzione si svolga durante i regni di Carlo III e Carlo IV di Spagna, al suo completamento, all'inizio del secolo XIX, la venuta delle truppe francesi in Spagna e la successiva guerra di indipendenza lasciarono tracce pesanti nell' edificio, che era destinato a fini militari (caserma della cavalleria), arrivando quasi alla distruzione totale. Solo grazie all' interesse manifestato da Ferdinando VII e, soprattutto, della sua seconda moglie Maria Isabella di Braganza a partire dal 1818 inizia il suo recupero della struttura sulla base di nuovi disegni proprio del Villanueva, sostituito alla morte dal suo discepolo Antonio López Aguado.
La prima denominazione del museo, Museo Real de Pinturas, venne attribuita il 19 novembre 1819, mettendo in mostra alcune delle migliori opere della Collezione Reale Spagnola, trasferite dai vari siti reali. Il salone ovale (l'attuale Sala di Velázquez), che a quel tempo aveva un balcone da cui si poteva vedere la galleria della scultura del piano sottostante, verrà battezzato, in seguito, in riconoscimento al suo lavoro. In questo periodo il museo conta 3 sale e 311 quadri, tuttavia negli anni successivi si aggiungeranno nuove sale ed opere d' arte, rendendolo indipendente dall'aggregazione con i fondi del polemico Museo de la Trinidad, creato a partire da opere d' arte sequestrate in virtù della Ley de Desamortización di Mendizábal (1836) e fuso con il Prado nel 1974.
