Les œuvres des peintres Diego Vélasquez, Francisco Goya, et Jérôme Bosch sont les plus célèbres et les plus nombreuses mais il y a aussi celles du Greco, de Pierre Paul Rubens, Anton van Dyck, Raphaël, Titien, Antonio Moro, Tintoretto, Bartolomé Esteban Murillo, Francisco de Zurbarán, José de Ribera, ainsi que des tableaux de Fra Angelico, Botticelli, Andrea Mantegna, Véronèse, Le Caravage, Albrecht Dürer, Rembrandt, Nicolas Poussin, Claude Gellée, Watteau, etc.
Le musée détient aussi des collections de dessins et d'estampes (quelque 6 400 dessins et 3 000 estampes), un fonds d'un millier de sculptures (dont une importante collection de sculptures gréco-romaines) et un grand nombre d'objets décoratifs et de documents historiques. Après les travaux d'agrandissement dirigés par Rafael Moneo, il expose en permanence une collection de 1 300 œuvres dans son siège, plus 3 000 prêtées pour être exposées dans d'autres galeries et institutions officielles.
L'édifice central qui sert aujourd'hui de siège au musée national du Prado est construit à l'initiative de José Moñino y Redondo, comte de Floridablanca et principal ministre de Charles III. Il est dessiné par l' architecte Juan de Villanueva en 1785 comme cabinet de sciences naturelles. À cause des événements de l' histoire, la construction ne sera toutefois achevée que sous Ferdinand VII, petit - fils de Charles III.
Poussé par son épouse, la reine Marie-Isabelle de Portugal (1797-1818), le roi prend la décision de destiner cet édifice à la création d'un musée royal de peintures et de sculptures. Le musée se nourrit dans un premier temps des collections royales, d'où sa première dénomination de musée royal. Il est bientôt renommé « Musée national de peinture et de sculpture » et, par la suite, « musée national du Prado », il ouvre pour la première fois au public en 1819. Son premier catalogue se compose de 311 peintures, même si le musée conserve déjà 1 510 œuvres originaires des collections royales.
