A partir de 1434, año en el que Cosme el Viejo regresa triunfalmente de su exilio veneciano al que había sido sometido por el gobierno veneciano, la familia Médici ejercerá en Florencia un poder de hecho (para el que se acuñó la definición de "criptoseñorío") que se consolidó con Pedro de Cosme llamado el Gotoso y su hijo Lorenzo el Magnífico. En 1494 Pedro el Fatuo, incapaz de oponerse eficazmente a la entrada del rey de Francia Carlos VIII en Florencia, se ve obligado a huir. Se restaura en la ciudad el régimen republicano, a la vez que Pisa recupera su independencia, que perderá de nuevo en 1509.
El retorno de los Médici (1512) puso al frente del gobierno de la ciudad al cardenal Julio, hijo natural de Juliano de Cosme, que en 1522 será elegido papa con el nombre de Clemente VII. Sin embargo, en 1527, tras el Saco de Roma por parte de las tropas de Carlos V, los florentinos se rebelaron, proclamando de nuevo la república : para derrotar a este último régimen republicano fue necesario que se aliaran el papa Médici y el Emperador, tras un largo sitio. En 1531 Alejandro de Médicis toma posesión del gobierno de la ciudad ; el año siguiente será nombrado Duque. Murió en 1537 a manos de Lorenzino de Médici, también llamado Lorenzaccio, hecho sobre el que Alfred de Musset escribió una obra de teatro. El gobierno fue asumido por Cosme, hijo de Giovanni dalle Bande Nere, descendiente de otra rama, y de María Salviati, nieta de Lorenzo el Magnífico. El nuevo duque inició una política expansionista que culminará con la conquista de Siena (1555), ratificada por el rey de España, Felipe II en el marco del Tratado de Florencia (1557) que supondrá también la creación del Estado de los Presidios, bajo control de virreyes españoles, en el Argentario, antigua área de influencia senesa.
Con la bula emitida por el papa Pío V el 27 de agosto de 1569 Cosme alcanza el título de gran duque de Toscana.